Diplômé en art à l'Université de Denver, Don Cheadle passe de nombreuses auditions qui aboutiront en 1986 à une participation à la série télévisée Fame. Après une apparition dans Les Zéros de conduite (Moving Violations), sa carrière sur grand écran décolle en 1987 grâce à John Irvin, qui lui confie le rôle du soldat Washburn dans
Hamburger Hill, puis à Dennis Hopper qui l'engage sur le tournage de Colors en 1988. Mais il doit attendre jusqu'en 1995 pour s'imposer comme un des meilleurs seconds rôles du cinéma américain.
Il donne ainsi la réplique à Denzel Washington dans Le Diable en robe bleue, Tommy Lee Jones dans
Volcano (1997), Mark Wahlberg dans Boogie Nights (1998), Warren Beatty dans Bulworth (id.), Nicolas Cage dans Family Man (2000), Gary Sinise dans
Mission to Mars (id.), John Travolta dans Opération Espadon (2001) ou encore Sean Penn dans The Assassination of Richard Nixon (2004). Fidèle à Steven Soderbergh, Don Cheadle interprète sous sa direction un malfrat boxeur (Hors d'atteinte), un flic tenace (
Traffic) ainsi qu'un braqueur cool dans Ocean's Eleven (2001) et ses suites. Il rejoint un autre casting prestigieux, celui de Coup d'éclat avec Pierce Brosnan et Salma Hayek. L'année 2005 marque un tournant décisif dans sa carrière puisque, pour la première fois, il tient le premier rôle d'un grand film : Hotel Rwanda qui lui a valu plusieurs prix et nominations. Fort de ce succès, il souhaite tourner lui-même l'adaptation d'un roman d'Elmore Leonard, Tishomingo Blues, dans lequel il se met en scène aux côtés de Matthew McConaughey. Le projet n'a cependant pas abouti.
Après son rôle dans Hotel Rwanda en 2004, qui relate le génocide rwandais du début des années 90, il s'engage pour cette cause. En janvier 2005, il se rend au Soudan avec 5 membres du Congrès pour visiter des camps de réfugiés et rencontrer des survivants de la guerre civile au Darfour, puis témoigne dans un reportage télévisé.
Don Cheadle est aussi un joueur de poker, et co-fondateur (avec Annie Duke) du tournoi Hold'Em à but caritatif "Ante up for Africa", dont la moitié du buy-in total est reversé à des associations contre la crise au Darfour.
Il a participé au projet du célèbre documentaire Les Fantômes du roi Léopold (King Leopold's Ghost), inspiré du livre controversé d'Adam Hochschild) en tant que narrateur ; documentaire qui a, par ailleurs, remporté de nombreux prix à travers le monde.