Soeur aînée de Mathilde Seigner - comédienne comme elle - et de la chanteuse Marie-Amélie Seigner, elle est la petite-fille du comédien Louis Seigner (1903-1991) et la nièce de Françoise Seigner, tous deux sociétaires de la Comédie-Française. Son père est photographe, sa mère journaliste. Scolarisée chez les soeurs, elle devient mannequin à l'âge de 14 ans et abandonne ensuite cette profession pour le cinéma.
Elle s'est révélée au public par le film Détective, de Jean-Luc Godard, puis par le thriller parisien de Roman Polanski, Frantic. Elle dévoile une autre facette de son jeu avec Lunes de fiel ; histoire d'un écrivain américain vivant à Paris tombant follement amoureux d'une jeune parisienne. Elle est par la suite longtemps absente du grand écran mais revient dans La Neuvième Porte. Ensuite, Emmanuelle Seigner se fait plus discrète, avec Place Vendôme et Backstage.
En 2007, elle revient sur le devant de la scène grâce à un album rock'n'roll, aux teintes sixties, écrit et composé par le groupe Ultraorange avec lequel elle entame une tournée à travers l'Europe. Deux succès cinématographiques ont couronné cette incursion musicale : La Môme d'Olivier Dahan où elle campe une prostituée très parisienne et haute-en-couleur puis
Le Scaphandre et le papillon où elle joue l'ex-femme de Jean-Dominique Bauby, ancien rédacteur en chef du magazine ELLE, atteint du « Syndrome d'enfermement ». Elle est une ambassadrice de la marque polonaise Dr Irena Eris.