John Stamos, de son vrai nom Stamotopoulos, est le fils d'une mère irlandaise et d'un père Grec. Ses grand-parents, lorsqu'ils émigrèrent aux États-Unis, choisirent de raccourcir leur patronyme en Stamos.
John démarre sa carrière au début des années 1980 dans « General Hospital », un soap populaire qui a lancé de nombreuses stars. Parallèlement, il poursuit une carrière de musicien, une autre passion. Il accompagnera même les Beach Boys en tant que batteur (on l'aperçoit dans le clip de la chanson Kokomo), il fera aussi le chant et la guitare sur une reprise de Forever, interprétée dans les années 70 par Dennis Wilson.
C'est en 1987 qu'il rencontre le succès grâce à la série « la fête à la maison ». Pendant huit ans il va être l'oncle Jesse de la famille Tanner. Très populaire, c'est l'annonce de son départ à la fin de la huitième saison qui a provoqué l'arrêt de la série en 1995.
Après « la fête à la maison », John s'est consacré tantôt au cinéma, tantôt à la télévision, mais sans avoir de personnages vraiment marquants. Il obtient ainsi des petits rôles dans « Alerte à Hawai » ou « Femme Fatale » de Brian De Palma.
En 2001, John est de retour dans un premier rôle à la télévision avec « Voleurs de charme ». Sa partenaire à l'écran n'est autre que Melissa George, madame Michael Vaughn dans la troisième saison d'Alias. La série est un succès critique, mais le public ne suit pas : elle sera arrêtée après seulement 10 épisodes. John fera ensuite des apparitions remarquées dans « Friends » (il joue un donneur potentiel pour le bébé de Monica et Chandler) et dans « Urgences » (John incarne Tony Gates, un infirmier au passé trouble).
Ces rôles permettent à John Stamos de sortir de sa traversée du désert. Il deviendra le héros d'une nouvelle série, « Jake in progress » un attaché de presse de New York qui recherche l'âme soeur. Après une bonne première saison, la série est menacée de disparition à l'issu d'une deuxième moins réussie. Mais qu'importe puisque John a déjà de nouveaux projets.
Sa participation à deux épisodes lors de la douzième saison d'Urgence a été très remarquée. L'acteur, déjà engagé dans « Jake in progress » ne pouvait pas rester plus longtemps. L'arrêt de celle-ci lui permet de reprendre du service au Cook County dès la rentrée prochaine !
Après être sorti avec Paula Abdul, Demi Moore ou encore Lori Loughlin (sa partenaire dans « la fête à la maison »), John s'est mariée avec
Rebecca Romijn, alors mannequin pour la marque Victoria's Secret (elle s'est reconvertie par la suite en actrice) en 1998. Ils ont divorcé en mars 2005.