Iosseliani étudie d'abord le piano à l'école de musique de Tbilissi (il est diplômé de piano, de composition et de direction d'orchestre). En 1953, il entre à l'université de Moscou pour suivre des cours de mathématiques et mécanique, il y reste jusqu'en 1955. Il s'aperçoit que suivre ce type d'études en Union soviétique signifie être recruté par l'Armée et y être retenu. Pour se dégager en douceur, il s'oriente vers des études de mise en scène à l'Institut de cinéma de l'Union soviétique (VGIK). Il y réalise en 1958 son premier film Aquarelle qui passera à la télévision.
En 1961 il réalise Avril. Le film, interdit, ne sera vu en Union soviétique qu'à partir des années 1970.
Iosseliani devient alors pêcheur puis ouvrier métallurgiste, ce qui le ramènera au cinéma deux ans plus tard, avec la réalisation de La Fonte, documentaire sur le travail d'ouvriers d'une fonderie.
En 1967 sortira
La Chute des feuilles, le film sera retiré de la distribution en URSS. Il passera cependant les frontières pour être présenté au Festival de Cannes.
1968, Vieilles chansons géorgiennes est interdit par le Comité de Cinéma de Tbilissi. Pour Il était une fois un merle chanteur (1971) la distribution sera limitée aux ciné-clubs mais le film passera également les frontières et arrivera à Cannes en 1974 avec Otar Iosseliani. En 1976, Pastorale est interdit jusqu'en 1979, année où Iosseliani est nommé Personnalité émérite des Arts de Géorgie.
À partir de 1982, Iosseliani travaille en France : il y tourne une Lettre d'un cinéaste pour l'émission de télévision Cinéma, cinéma. En 1983, toujours pour la télévision, il tourne un documentaire Euskadi.
1984, nouveau long-métrage de cinéma :
Les Favoris de la lune, qui obtiendra le Prix spécial du jury à la Mostra de Venise. Iosseliani est nommé Artiste du Peuple de Georgie. L'année suivante il tourne un documentaire pour la télévision Petit monastère en Toscane.
En 1989 Et la lumière fut obtient le Prix spécial du jury à la Mostra de Venise.
La Chasse aux papillons sort en 1992.
Nicolas Zourabichvili, compositeur français d'origine géorgienne, assure la collaboration musicale pour nombre de ses films.
En 1994 Arte diffuse le triptyque documentaire Seule, Géorgie.
Avec
Brigands, chapitre VII (1996), Otar Iosseliani obtient son troisième Prix spécial du jury à Venise.
En 1999
Adieu, plancher des vaches ! se voit récompenser du Prix Louis-Delluc.
En 2001 sort Lundi matin qui se voit décerner L'Ours d'argent au Festival de Berlin.