Il commence sa carrière dès 1906 et joue au cinéma à partir de 1916. Il se spécialise rapidement dans les rôles de méchants, où il se taille un franc succès.
Alfred Hitchcock l'utilisera à quatre reprises, comme par exemple en 1929 dans le film
Blackmail. Il apparait dans le film à sketches Elstree Calling (1930), resté inédit en France.
Donald Calthrop a aussi tourné dans loose Ends (1930), Rome Express (1932), I Was a Spy (1933), Scrooge (1935), Dreaming Lips (1937) et La Commandante Barbara (1941), son dernier film.