Il débute sa carrière de comédien au théâtre au Texas. En 1991, il décroche son premier rôle au cinéma, dans la comédie Strictly Business avec Samuel L. Jackson et Halle Berry. C'est en 1994 que sa carrière démarre réellement avec des seconds rôles. Il est révélé grâce au rôle du Dr Preston Burke, brillant chirurgien, dans la série télévisée Grey's Anatomy. Il est cependant renvoyé de la série le 8 juin 2007 après avoir tenu des propos homophobes contre l'acteur T.R. Knight (qui joue le personnage de George O'Malley dans la même série). Ce dernier a d'ailleurs été contraint de révéler son homosexualité quelques jours plus tard. Isaiah Washington essaie de se donner une meilleure image en enregistrant un spot publicitaire pour l'association GLAAD (Gay & Lesbian Alliance Against Defamation, une association combattant l'homophobie), mais sans succès. Il a eu un rôle récurrent dans la série télévisée Bionic Woman, où il joue le personnage d'Antonio Pope.
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“ Spike Lee prend le bus pour Washington. Sur la route, la parole dresse un portrait de ces passagers, différents horizons, même direction. ”— Kronan30 avril 2015
“ Très bon film basé sur Les sniper de Washington ! Vu en VO le film et vraiment super bien réalisée et nous plonge dans l'enfer des victimes. ”— BlacKRideRZ62 8 septembre 2016
“ Une des plus puissantes introductions du genre, après vous pouvez levez l'ancre et allez faire autre chose la suite du film est anecdotique. ”— greg_movies12 juin 2013