Justin Long a percé au cinéma dans le rôle du commandant Brandon Wheeger dans le film de Dean Parisot, Galaxy Quest, avec Tim Allen et Sigourney Weaver.
Quelques années après, il remporte la consécration avec la nomination du Saturn Award pour le meilleur jeune acteur grâce à son interprétation de Darius "Darry" Jenner, l'adolescent pourchassé par un monstre dans le film d'horreur Jeepers Creepers, le chant du diable (Jeepers Creepers) de Victor Salva.
Repéré comme l'un des jeunes acteurs les plus prometteurs de sa génération, cette réputation valorisante lui vaut d'être sollicité par le cinéma indépendant et les blockbusters. On le retrouve dans Die Hard 4 : Retour en enfer de Len Wiseman, avec Bruce Willis,
Crossroads de Tamra Davis, La Coccinelle revient d'Angela Robinson, Dreamland de Jason Matzner, La Rupture de Peyton Reed, Admis à tout prix de Steve Pink et Idiocracy de Mike Judge.
Il a séduit de nombreux nouveaux fans dans la comédie à succès Même pas mal ! (Dodgeball) de Rawson Marshall Thurber. Justin Long interprète Justin aux côtés de la crème des comiques du cinéma américain populaire, Vince Vaughn et Ben Stiller, également producteur du film.
Son timbre de voix a été entendu dans Hair high réalisé par Bill Plympton, dans lequel il double Dwayne.
Sa carrière à la télévision lui a valu un rôle régulier dans la série Ed et des apparitions dans les séries Campus Ladies, King of the Hill et That '70s Show.
Au théâtre, Justin Long s'est produit au Festival du théâtre de Williamstown avec Hot I Baltimore. Il a aussi joué dans La Mélodie du bonheur et Le Roi Lear.
Justin vit actuellement entre New York et Los Angeles.
Il prête sa voix au personnage Alvin dans Alvin et les Chipmunks et compte bien continuer dans la suite prévue pour 2009-2010.
Et dernièrement au 62e Festival de Cannes, Justin Long était présent pour Jusqu'en Enfer présenté en hors compétition.
Il a vécu pendant trois ans, de 2007 à août 2010, avec l'actrice Drew Barrymore dont il s'est séparé plusieurs fois jusqu'à ce que celle-ci annonce officiellement leur rupture sur le tournage de leur film en commun Trop loin pour toi.