Parallèlement à ses études, Robert Vaughn commence à travailler en tant qu'acteur. Il fait sa première apparition à la télévision en 1955 dans un épisode de la série Medic intitulé « Black Friday ». Il jouera plus de 200 personnages dans des films, des téléfilms et des séries.
Il tient son premier rôle cinématographique dans Les Dix Commandements. Son rôle est mineur et n'est pas crédité au générique.
Sa première prestation cinématographique créditée a lieu en 1957 quand il joue dans Le Carrefour de la vengeance où il tient le rôle de Bob Ford, l'assassin de
Jesse James.
Sa prestation dans The Young Philadelphians (1959) lui vaut d'être proposé pour l'Oscar du meilleur second rôle. Mais c'est son rôle de Lee dans
Les Sept Mercenaires qui lui permet d'acquérir une stature nationale et internationale. Il reprendra un rôle similaire en 1980 dans l'adaptation futuriste, Les Mercenaires de l'espace puis celui du juge Oren Travis dans la série éponyme (1998-2000). En 2008, Robert Vaughn était le seul des
Sept Mercenaires originaux encore en vie.
De 1964 à 1968, il joue le rôle de Napoléon Solo dans la série Des agents très spéciaux au côté de l'acteur britannique
David McCallum. Le succès de cette série permet le développement de merchandising ainsi que de suites sous la forme de téléfilm dans les années 1980.
En 1968, abonné au second rôle de premier plan, Robert Vaughn joue le rôle d'un homme politique ambitieux dans le film Bullitt au côté de
Steve McQueen. Parallèlement, l'acteur est aussi engagé politiquement. Membre du parti démocrate, il est sollicité par la branche californienne de ce dernier pour se présenter contre
Ronald Reagan, candidat républicain au poste de gouverneur de Californie en 1966. Vaughn refuse cependant et apporte son soutien à Edmund Brown qui est largement battu par Reagan. Opposé à la guerre du Vietnam et ami proche de Robert Kennedy, il soutient sa candidature en 1968 quand celui-ci recherche l'investiture du parti démocrate.
Au cinéma, à quelques exceptions près, la carrière de Robert Vaugnh se cantonne par la suite à des prestations de premier ou second ordre à la télévision ou dans des films de série B.